2024, Vol. 36 
 彭新湘，华南农业大学生命科学学院二级教授、博士研究生导师。1983年于湖南农业大学获农学学士学位，1986、1989年于华南农业大学分别获理学硕士、博士学位。1989年至今在华南农业大学从事科研与教学工作，其间在国际水稻研究所、美国旧金山州立大学和康奈尔大学开展博士后和访学研究。长期致力于植物光合作用与高光效机理及应用研究，在重构光呼吸通路创制高光效作物研究方面取得重要进展。近五年来，在Molecular Plant、Plant Physiology、The Plant Journal、Journal of Experimental Botany等核心学术期刊发表多篇研究论文 |
光呼吸是光养生物在光下吸收O2释放CO2的过程，源于核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的加氧反应。Rubisco催化核酮糖-1, 5-二磷酸(RuBP)羧化反应生成3-磷酸甘油酸(3-PGA)，后者进入光合碳循环实现碳固定；催化RuBP加氧反应生成3-PGA和2-磷酸乙醇酸(2-PG)。2-PG是光合碳循环多种酶的抑制剂，对光合作用可产生负调控作用[1-2]。光呼吸代谢以2-PG为起始底物，催化2分子2-PG最终再生为1分子3-PGA，此过程可以对2-PG进行解毒，同时实现对75%有机碳的回收[3]。
植物光呼吸已经历25亿~32亿年的演化历程，现在认为，光呼吸不仅仅只是一条2-PG代谢的补救途径，而且是植物在有氧环境下生长发育所必需的代谢过程。一方面，光呼吸整合到了植株整体代谢网络，影响植物光合作用、呼吸作用、氮同化、一碳代谢和细胞氧化还原平衡等基础代谢[4-5]。另一方面，光呼吸参与生物和非生物胁迫响应，是植物应对环境胁迫的重要组成部分[6-8]。因此，精准调节光呼吸代谢是维持植物高效光合作用和环境适应性的重要机制。
光呼吸与光合作用固定CO2过程同时发生，是C3植物中仅次于光合作用的第二大代谢流[9]。在大气环境条件下，光呼吸可降低C3植物20%~30%的光合效率[10]。鉴于光呼吸碳损耗和高耗能的特性，优化光呼吸代谢被认为是提高植物光合效率的一个关键突破口。近年来，科学家在Rubisco改良和光呼吸支路重构等方面取得重要进展。本文将系统总结近年来光呼吸演化、代谢调控和遗传改良方面的研究进展，并对未来作物高光效改良等提出一些思考。
1 光呼吸的演化谈光呼吸的演化问题，一定绕不开Rubisco，从其命名便可知它具有羧化与加氧双重催化活性。Rubisco起源于约35亿年前一种产甲烷的古细菌[11-12]，推测其祖先是一种在5ʹ-甲硫腺苷循环代谢中起催化作用的古烯醇酶[13-14]。至今已分辨出四种不同类型的Rubisco，通常表示为Ⅰ~Ⅳ，其中IV没有羧化酶活性，所以自然界光养生物中存在的为类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。类型Ⅲ可能是其他几种类型的共同祖先，但也有证据表明类型Ⅰ~Ⅲ是由类型Ⅳ演化而来[14-15]。Rubisco起源时环境中几乎没有氧，仅有的极微量氧气来自于紫外线对水的光解作用，其浓度仅为现在氧浓度的10-14 [16]，而CO2浓度却是现在的100倍以上[17]。正因为当时缺少选择压，即高浓度CO2和缺O2环境，导致起源时的Rubisco对CO2和O2的分辨特异性差，也就是说，在结构水平与催化机制方面Rubisco没有严格区分CO2与O2的能力。但由于当时极低的氧浓度，其实际加氧反应是可以忽略不计的。
大约27亿年前，随着蓝细菌放氧光合的出现，大气CO2开始被固定至生物质，部分沉积或不再返回全球碳循环[17]。与此同时，光合作用以H2O作为还原剂，通过光反应产生等量的氧释放至其局部环境和大气中[18]。因此，蓝细菌、藻类植物，尤其是随之演化而来的陆生植物，协力将大气氧浓度提升至了现今的水平(21%)，而CO2浓度下降到原来的1/100 [17, 19]。因为大气CO2/O2比值的急剧下降，强大的选择压虽然使Rubisco对CO2的特异性有所提高，譬如，某些厌氧光合细菌Rubisco的速率特异比(Sc/o)为15，蓝细菌为50~60，陆生植物可达80~130，均值为100左右。但遗憾的是，研究发现Rubisco速率特异比的提高总是以降低其最大羧化反应速率为代价[20-21]。尽管仍有科学家认为Rubisco的加氧反应是其起源时缺氧环境下产生的一种缺陷或失误，但也有研究表明现今的Rubisco已趋近完美状态[20]。因此，Rubisco的基因工程改造能否完成几十亿年来强选择压力下所没有完成的任务，仍要拭目以待。
随着系统学研究的进展，越来越多的证据表明光呼吸是伴随着古蓝细菌的放氧光合而共同演化[22-23]。这一假设首先是依据光呼吸的许多酶与蓝细菌中的蛋白同源[24-25]，并且认为只有在放氧光合出现后，随着大气氧的递增使Rubisco周围的氧浓度升高，才会激发其加氧反应产生2-PG。但也有学者反驳认为，地球有相当长的时期是处于一种缺氧状态，蓝细菌光合释放的氧气会快速释放扩散至大气中而被稀释。因此，直至23亿~24亿年前大气氧浓度才有一次爆发式提升，史称大氧化事件(Great Oxidant Events, GOE)，但浓度也只有现在氧浓度的1/100左右(0.2%~0.3%)，并且这一浓度持续了长达20亿年之久[23]。因此早先的观点认为，光呼吸是在5亿年前陆生植物定植大陆和大量繁衍后才得以演化，因为直至那时大气氧浓度才提升至接近现今的水平(21%)。但有新的证据表明，尽管蓝细菌放氧光合出现后相当一段时间的大气氧浓度依然相对较低，但海洋微生物群落形成了一种垫子式叠层结构(microbial mats or mat-building microbes)，类似于现代的叠层岩结构，表面被胞外多糖和无机沉积物覆盖[9, 26-27]。在这种条件下，光合作用产生的氧气可能大量富集于密集的蓝细菌群落结构内部，导致Rubisco周围的氧浓度会相当高[23]，于是加氧反应产生大量2-PG就不可避免。由于2-PG对细胞有毒性作用，在蓝细菌中共演化出一条原初的光呼吸通路以消除其毒害似乎是情理之中。
现已知在蓝细菌中主要存在两条彼此部分冗余的2-PG代谢途径：即类似于植物的光呼吸途径和细菌甘油酸途径[22, 28]。此外，在部分蓝细菌菌株中还发现一条乙醛酸氧化脱羧途径，即在草酸脱羧酶和甲酸脱氢酶的协同作用下将乙醛酸完全氧化为CO2[22, 28]。蓝细菌中这些代谢2-PG途径的发现令科学家非常意外，因为已知蓝细菌有CO2浓缩机制(CO2-concentrating mechanism, CCM)，所以长期认为诸如蓝细菌、藻类植物、C4植物等的光呼吸很弱，无需存在代谢2-PG的途径，也不应该有所谓的光呼吸表型。然而，利用CCM型生物的光呼吸突变体研究证明，它们也像C3植物一样，在空气中生长严重受阻甚至致死，只能在高浓度CO2环境中生长[22, 29-30]。由此看来，光呼吸功能在所有放氧光合生物中似乎是不可或缺的。
拟南芥中所有涉及光呼吸代谢的蛋白都与蓝细菌集胞藻6803的基因组有亲缘关系，并且它们都与代谢2-PG相关[28]，因此现行的观点认为，15亿年前蓝细菌通过原初内共生事件的发生，将其放氧光合与光呼吸一同转移至了某种真核藻类植物中，也从此开启了高等植物光合作用与光呼吸的演化之旅[22, 31-33]。但随着研究的进一步深入，发现大多数光呼吸酶可以溯源至更早的原核祖先古蓝细菌和古变形菌[24]。因此认为，光呼吸酶为混合式双重起源，其中Rubisco、甘油酸激酶(glycerate kinase, GLYK)和乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase, GLO/GOX)起源于蓝细菌，而甘氨酸脱羧酶(glycine decarboxylase, GDC)、丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethy-ltransferase, SHMT)、羟基丙酮酸还原酶(hydroxy-pyruvate reductase, HPR)和谷氨酸: 乙醛酸氨基转移酶(glutamate: glyoxylate aminotransferase, GGAT)则由变形菌起源[25, 31, 34]。但也有证据显示，陆生植物GLO是由真核生物最后的共有祖先的一个基因遗传而来，而该基因本身又是从细菌的乳酸氧化酶衍生而来[35]。光呼吸酶由蓝细菌和变形菌双重起源的理论似乎与现代陆生植物光呼吸和光合作用是从蓝细菌共演化而来的观点不太相符。但已有越来越多的证据表明，现代陆生植物基因组来自不同内共生事件，不但有起源于洛基古菌祖先的真核寄主细胞的基因，而且多数来自古蓝细菌和古变形菌的内共生事件[27, 32-33, 36]。因此，变形菌(线粒体祖先)对现代植物光呼吸的贡献可以理解为，虽然蓝细菌中GDC、SHMT、HPR和GGAT的同源基因通过原初内共生事件应该是一同转移至了真核寄主中，但因为与真核寄主线粒体中已存的基因功能冗余，以致在随后的内共生基因转移(EGT)和原藻基因组分离过程中，蓝细菌自身某些酶的基因拷贝丢失[27]，只有很少量保留了下来，如GDC中L亚基的一个拷贝是蓝细菌起源的[25]。但进一步的问题是，蓝细菌光呼吸的酶又源自哪里？基因组比对分析发现，光呼吸酶基因的同源序列在大多数异养细菌基因组中都能找到，因此认为代谢2-PG的酶可能还早于放氧光合的演化[25, 27]。
2 光呼吸代谢调控光呼吸代谢源于Rubisco的加氧反应。从源头上看，光呼吸通量受Rubisco加氧酶活性及其周围O2/CO2分压的影响。光呼吸基因和代谢酶也受到各个层面的调控，以协调植物适应不同环境所需的光呼吸通量。
2.1 光和CO2对光呼吸基因的调节光呼吸是植物在光照条件下发生的代谢过程，与光合作用基因类似，许多光呼吸基因具有光响应元件(light-responsive elements, LREs)，介导光诱导的基因表达[37]。Genvestigator数据库转录谱显示，拟南芥光呼吸核心酶编码基因的转录表达几乎都会受到光诱导，包括光呼吸核心酶编码基因PGLP1、HPR1、GGT1、SGAT、SHM1和GDC-H/P/L/T，以及光呼吸氮循环相关基因GS2和GLU1[38-39]。相反，这些基因的转录表达均被渗透胁迫和低硝酸盐处理抑制[38]，这也说明光呼吸基因通常以整体上调或下调的方式响应环境变化。光呼吸基因转录表达受到高光、高温和干旱等胁迫的诱导上调，参与植物对逆境胁迫的响应[6, 8]。光呼吸是消耗能量和还原力的代谢过程，正常光照条件下可消耗C3植物32% ATP和28% NADH，逆境条件下此比例更高[40]。逆境胁迫下光呼吸通过消耗过剩的能量和还原力，可阻止细胞活性氧(ROS)积累，增强植物的抗逆性。研究表明，过量表达拟南芥PGLP1、HPR1或水稻GLO1，可以增强植物对高温、高光等非生物胁迫的抗逆性，提高逆境下光合作用效率[41-43]。
在波动光或光暗转换环境下，植物的光呼吸基因可能产生可变剪接或者启动子可变选择，并影响光呼吸代谢。拟南芥GLYK基因存在受光敏素调控的可变启动子，可在不同转录起始位点转录出不同长度的mRNA，产生具有不同N-端的蛋白质异构体。光照条件下转录的长mRNA编码质体定位的ptGLYK，暗条件下转录的短mRNA编码胞质定位的cytGLYK[44]。cytGLYK催化细胞质中甘油酸生成3-PGA，后者再进入光合碳循环，构成了一条光呼吸旁路。胞质GLYK旁路减少了叶绿体中的ATP消耗，增加了ATP/NADPH比例，可减轻波动光诱导的光抑制作用[44]。拟南芥和水稻中都存在两种HPR蛋白，即过氧化物酶体定位的HPR1和胞质定位的HPR2，分别由不同基因编码[45-46]。而南瓜的两个HPR异构体则由同一个前体mRNA通过内含子可变剪接产生：HPR1定位于过氧化物酶体，HPR2则位于细胞质中，其合成受发育阶段和光信号的调节[47]。通过形成不同转录本或对原初转录本的可变剪接，可灵活高效地控制光呼吸基因的表达种类、数量以及亚细胞定位，调节光呼吸代谢。
大气CO2是影响植物光合作用和光呼吸的重要环境因子。一方面，高浓度CO2促进Rubisco羧化酶活性，提高植物光合速率和碳的固定；另一方面，通过与O2竞争Rubisco酶活性中心，高浓度CO2可抑制植物光呼吸代谢[48]。研究表明，提高环境CO2浓度短期内可显著提升C3植物的光合速率，而长期生长于高浓度CO2下会出现CO2适应(CO2 acclimation)现象，即植物光合速率下降、生长减缓[49-50]。有研究认为CO2适应现象与光呼吸的抑制有关，因光呼吸促进叶绿体中苹果酸向外转运，后者在细胞质中可为硝酸还原提供反应所需的NADH，当光呼吸受抑时会抑制硝酸还原和氮的同化作用[51-52]。
不同CO2浓度直接调节Rubisco羧化/加氧活性，还影响光呼吸基因的表达。转录组数据显示，莱茵衣藻中大多数光呼吸基因的转录水平被低浓度CO2诱导上调[42]；然而，在拟南芥中，无论是短时间从高浓度CO2 (1% CO2，低光呼吸)转移到大气CO2环境(0.04% CO2，高光呼吸)，或是长时间高浓度CO2适应，均未显著改变光呼吸基因的转录表达[53-54]，这也暗示CO2对植物光呼吸代谢的调节存在多样的方式，比如对光呼吸酶的过硫化修饰等[55-56]。
2.2 蛋白质翻译后修饰调节光呼吸代谢酶随着蛋白质组学技术的发展，大量潜在的具有翻译后修饰(post-translational modification, PTM)的肽段得到鉴定，这些修饰包括蛋白质磷酸化、泛素化、乙酰化，以及氧化还原修饰例如亚硝基化、谷胱甘肽化、次磺酸化、过硫化修饰和二硫键形成等。其中，磷酸化修饰和氧化还原修饰是光呼吸酶最为常见的PTM形式(表 1)。
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表 1 拟南芥中光呼吸酶常见的翻译后修饰形式及其位点 |
根据数据库Plant PTM Viewer (https://www.psb.ugent.be/webtools/ptm-viewer) [57]，几乎所有的光呼吸酶都有潜在的磷酸化修饰位点(表 1)，但目前只有少数几个得到确认及功能研究。
拟南芥SHMT1第31位丝氨酸(Ser31)是潜在的磷酸化修饰位点，将此氨基酸模拟磷酸化(S31D)或非磷酸化(S31A)转化shm1-1突变体，均能恢复突变体黄化矮小的表型；然而，在盐或干旱胁迫时，S31D互补株系出现严重的生长缺陷；研究显示，Ser31磷酸化SHMT1蛋白的稳定性下降，其酶活性降低[60]。拟南芥HPR1第335位酪氨酸(Tyr335)模拟磷酸化(T335D)或非磷酸化(T335A)转化hpr1-1突变体，发现T335A能完全回补hpr1-1光呼吸表型，而T335D互补株系则不能，表明Tyr335磷酸化调节拟南芥HPR酶活性[61]。对拟南芥和玉米GLO潜在的磷酸化位点进行突变，体外表达蛋白后进行酶活性测定，发现拟南芥GLO模拟磷酸化突变(T4D、T158D和T265D)抑制其酶活性，玉米对应位点也呈现类似的特点[62]。有研究表明，水稻MAPK2 (mitogen-activated protein kinase 2)与光呼吸酶GLO和HPR存在相互作用，可磷酸化修饰GLO和HPR并降低其酶活性；研究还发现，mapk2突变体光呼吸速率下降，光呼吸代谢中间产物积累减少，证实MAPK2是一个光呼吸相关蛋白激酶[63]。
2.2.2 氧化还原修饰光呼吸酶光依赖的蛋白质氧化还原修饰广泛参与光合作用相关的代谢过程，包括光合电子传递、Rubisco活化、光合碳循环、叶绿素和淀粉合成等，从而实现植物多条代谢途径的协同运行和对光能的高效利用[64-66]。光呼吸也是光依赖的代谢过程，目前对光呼吸酶的氧化还原修饰研究不多。
氧化还原蛋白质组学数据表明，几乎所有的光呼吸代谢酶都可以被巯基参与的氧化还原所调节(表 1)。线粒体甘氨酸脱羧酶(GDC)是光呼吸代谢调控的关键酶，也是氧化还原调节的主要靶点[67]。组学数据表明，GDC亚基(GDC-H/L/P)受到亚硝基化、谷胱甘肽化和过硫化修饰，GSNO (NO供体)处理抑制GDC酶活性[68-69]。拟南芥er-ant1突变体中甘氨酸和ROS积累，呈现典型的光呼吸表型；其机制可能是过量积累的ROS通过氧化修饰GDC亚基，降低了GDC酶活性[70]。蛋白质组学数据显示，光呼吸酶广泛存在硫化氢(H2S)介导的过硫化修饰，尤其是在非光呼吸条件下(0.7% CO2)；光呼吸酶的过硫化修饰影响其酶活性，比如，外源NaHS (H2S供体)处理可以显著提高谷氨酰胺合成酶(GS)、HPR和GLO酶活性[67-68]。此外，蛋白质互作数据也为光呼吸酶的氧化还原调节提供了新的线索，比如，拟南芥PGLP1与叶绿体内氧化还原作用因子2-Cys PRX (2-Cys-peroxiredoxin)、NTRC (NADPH-Trx reductase C)存在互作[71-72]。
光呼吸酶的氧化还原修饰或许不是直接发生的，而是通过硫氧还蛋白(Trx)或谷氧还蛋白(Grx)介导完成。植物Trxs种类众多，分布广泛，拟南芥包含7个亚家族(Trx h、o、f、m、x、y、z) 20多种不同的异构体，分别定位在叶绿体、线粒体、细胞核、内质网和细胞质[66]。研究表明，拟南芥线粒体定位的Trx o1和Trx h2介导GDC-L/mtLPD1的氧化还原修饰，调节mtLPD酶活性和光呼吸代谢[73-74]。有意思的是，mtLPD不仅是GDC的亚基，同时也是线粒体丙酮酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶的亚基。在这些酶系统中，mtLPD负责将电子传递给NAD+形成NADH，因此，Trx o1、Trx h2可能通过调节mtLPD酶活性调控线粒体NADH的产生；反之，Trxs通过感知线粒体氧化还原状态(NADH/NAD+比值)，可以反馈调节mtLPD的酶活性。在光照条件下，Trxs的这种调节机制很好地微调了光呼吸和三羧酸循环流量，协助植物更好地适应外界环境的变化[67]。
2.3 光呼吸酶的互作和光呼吸H2O2的调控生物体代谢酶并不总是均匀分布在细胞中，一些代谢途径中连续催化的多个酶可以在时间和空间上聚集在一起，形成瞬时的结构-功能复合体，称为代谢子(Metabolon)[75]。代谢子涉及蛋白质表面之间的多价相互作用，可能伴有液-液相分离(liquid-liquid phase separation, LLPS)，形成无膜微区域[76]。微区域内集合了代谢所需的必要成分，代谢中间产物在复合体内被酶连续转化，从而形成底物代谢通道[76]。植物中多个代谢途径已被证实存在酶-酶互作和代谢通道，比如糖酵解、三羧酸循环、嘌呤核苷酸和淀粉合成等[77-79]。
利用菠菜叶片分离的过氧化物酶体进行实验，发现在膜完整和膜破损情况下，甘油酸以相同的速率产生，表明过氧化物酶体中的光呼吸酶可能以代谢子形式存在，中间产物形成代谢通道[80-81]。水稻过氧化物酶体中GLO催化乙醇酸生成乙醛酸，并伴随H2O2产生，过氧化氢酶(catalase, CAT)催化H2O2的分解。研究发现，GLO与CAT存在动态互作，其互作/解离状态受到水杨酸(SA)的调节[82-83]。研究进一步证实GLO-CAT复合体中存在高效的H2O2代谢通道，细胞及植株水平的实验表明SA、CO2以及光/暗变化等均可诱导GLO-CAT互作/解离状态发生快速可逆性变化，从而导致H2O2波动性发生[84-85]。这些研究表明，光呼吸酶之间的互作形成底物通道，可调节代谢速率和光呼吸代谢通量，从而快速响应环境变化。
光呼吸途径产生的H2O2在植物生物和非生物胁迫响应中发挥重要作用。干旱胁迫下C3植物70%的H2O2来自于乙醇酸的氧化[86]。在拟南芥和番茄中，抑制GLO编码基因的表达会减少H2O2的产生，降低植物的抗病性[87-88]。研究发现，植物叶片局部机械损伤可快速诱导系统叶片中GLO-CAT互作增强，降低光呼吸H2O2水平，此过程依赖谷氨酸盐受体和钙信号；在该研究中还观察到，光呼吸H2O2下降与质外体H2O2升高形成反向时空互作，这是一种新的H2O2系统信号时空及稳态调节机制[85]。
2.4 光呼吸代谢物的反馈调节作用2-PG是磷酸丙糖异构酶、景天庚酮糖-1, 7-二磷酸酶和磷酸果糖激酶的抑制剂，调节光合碳循环和糖酵解[1-2]。研究表明，2-PG作为代谢信号物质(或调节因子)，影响植物体内碳的利用和分配。例如，通过改变PGLP1的表达量，2-PG调节光合碳循环向RuBP再生与淀粉合成的碳流分配，较低水平的2-PG促进淀粉的生物合成[2, 89]。也有研究报道，2-PG和α-酮戊二酸(2-OG)协同调节植物体内的碳氮平衡。在正常情况下，Rubisco羧化反应产生大量磷酸丙糖，后者进入三羧酸循环生成α-酮戊二酸(2-OG)，作为碳骨架参与氮的同化作用[90]；而CO2浓度较低时，Rubisco加氧反应促进2-PG的积累。研究显示，2-PG与2-OG在蓝细菌中的浓度是负相关的，两者通过与NAD(P)H脱氢酶调节子(NdhR)的竞争性结合调节碳氮平衡[91-92]。当蓝细菌中氮浓度偏低时(碳过剩)，2-OG浓度升高，NdhR与2-OG结合后与DNA启动子区域的亲和力增强，从而抑制碳转运相关基因的转录；而当碳浓度偏低时，2-PG结合NdhR并诱导其构象发生变化，解除其转录抑制子活性，促进碳转运相关基因大量表达[91]。
乙醛酸抑制叶绿体中Rubisco的活性和植物光合作用[93-94]。水稻中下调GLO表达会同时导致乙醇酸和乙醛酸的积累，但只有乙醛酸的含量与Rubisco活化状态、光合速率呈显著负相关[94]。在拟南芥和水稻中均鉴定到胞质定位的乙醛酸还原酶(glyoxylate reductase)，其催化乙醛酸转化为乙醇酸，且对乙醛酸具有很高的亲和力，表明植物乙醛酸的积累受到严格的调控[95-96]。丝氨酸被认为是一种代谢信号物质，反馈调节光呼吸基因的转录表达。外源丝氨酸处理后，拟南芥光呼吸基因(比如PGLP1、SHM1、GLYK等)转录水平不再受到光诱导[39]。通过对不同气体条件下(2%、20%、40% O2)烟草叶片光呼吸流量的定量分析，发现高光呼吸条件下甘氨酸通常会大量积累，其作为光呼吸代谢中间产物中相对无毒的分子，是一个安全缓冲库；而由甘氨酸转化而来的丝氨酸可从光呼吸循环中大量逸出。根据流量计算，约有23%~41%的光呼吸碳以丝氨酸的方式从循环中输出，作为氮源用于氨基酸和蛋白质的生物合成[97]。总的来说，当植物遭遇环境变化时，光呼吸通过其代谢物水平的变化，对Rubisco、光合碳循环等形成反馈调节，从而调节光呼吸与固碳之间的平衡和代谢流量。
3 光呼吸的遗传改良 3.1 提高Rubisco羧化效率Rubisco是光合碳同化过程的核心酶，然而Rubisco的羧化效率非常低(较低的转化数和CO2亲和力)，是整个光合代谢途径的限速酶[98-99]。因此，对Rubisco进行工程改造以提升其CO2固定效率，是提高C3作物光合作用效率的重要策略之一。
高等植物Rubisco是由8个大亚基(RbcL)和8个小亚基(RbcS)组成的L8S8十六聚体结构[100-101]。Rubisco活性位点位于相邻RbcL形成的二聚体内部，其活性位点无法严格区分CO2和O2[102]，使得Rubisco不可避免地固定氧从而导致能量和碳损失(光呼吸过程)。过去几十年，研究人员一直希望通过筛选Rubisco突变体或基因工程改造RbcL活性中心，以同步提高Rubisco的羧化速率和CO2特异性，但一直未能取得有效进展[103-105]。
相比C3植物，C4植物与一些固碳微生物具有更高的羧化速率，例如常见的C3作物水稻、小麦、马铃薯等Rubisco的羧化反应转化数(Kccat)仅为1~3 s-1，C4作物玉米、甘蔗的Kccat介于4~5 s-1，而属于蓝细菌成员之一的细长聚球菌其Kccat高至14 s-1 [12, 106-107]。生化模型预测，若能将C4植物或蓝细菌等的Rubisco导入C3植物，有望显著增加C3植物的固碳效率，增产25%~30% [21, 108]。然而Rubisco在叶绿体中的折叠组装与活化机制非常复杂，往往需要一系列辅助因子(如叶绿体伴侣蛋白Cpn60、Rubisco积累因子Raf1)和活化酶，现已知只有少数异源Rubisco可在C3植物体内表达并组装形成有功能的Rubisco全酶。Lin等[108]构建了蓝细菌大、小亚基及其装配蛋白的多基因表达载体，通过质体转化技术将这些基因转化至烟草叶绿体基因组并敲除了烟草自身的RbcL基因，获得的转基因烟草可组装出有活性的蓝细菌Rubisco全酶，该Rubisco虽然具有更高的羧化活性和CO2同化速率，但其表达量以及与CO2的亲和力均较低，以致该转基因烟草仅能在高CO2条件下(9 000 ppm)正常生长[109]。红藻的RbcL与RbcS被证实能够很好地在烟草叶绿体中自行组装，将其与红藻Rubisco活化酶一同转入烟草，能显著提升Rubisco的羧化速率。但其Rubisco同样表现出较低的CO2亲和力，该植株无法在正常大气条件下存活，只有在高CO2条件下才能正常生长，光合效率和生物量无明显上升[110]。变形菌来源的Rubisco也可在无外源组装辅助因子的条件下在烟草叶绿体中形成有活性的Rubisco全酶，然而其转基因植株也只可在高CO2环境中存活。此外，利用C4作物高粱的RbcS基因替换水稻自身RbcS基因，获得的杂合Rubisco也表现出与上述Rubisco相似的催化特性，该水稻材料只在高浓度CO2条件下才表现出更高的CO2同化速率[111]。
值得注意的是，近年来一些研究通过对自然界不同物种来源的Rubisco进行比较分析发现，不同光养生物自然变异的Rubisco其羧化速率(Kccat)与CO2特异性(Sc/o)存在负相关的关系，即具有较高Kccat的Rubisco对CO2的亲和力与特异性反而较低(Kc较高，Sc/o较低)[112-114]，这与上述转基因植物中新组装的Rubisco相较于其本底Rubisco表现出的催化特性的变化趋势相一致。因此，现阶段通过遗传改良Rubisco来提高C3植物光合固碳效率，仍面临理论和实践的挑战。
3.2 加速光呼吸代谢，促进光合速率如前所述，2-PG、乙醛酸等物质的积累可抑制光合碳循环的一些关键酶。因此，提高光呼吸代谢速率，降低其中间代谢物积累水平，或许可以提高植物光合效率。为了确定光呼吸代谢的限速步骤，研究人员将拟南芥等从高CO2生长环境中转移至正常大气条件，发现甘氨酸水平短时间内大量积累，表明甘氨酸到丝氨酸的转化过程可能是光呼吸的限速步骤之一[115]。随后对C3植物中光呼吸酶编码基因进行过表达，通过比较分析发现，GDC活性上调可显著降低植物中甘氨酸的积累，同时也减少光呼吸其他代谢物的含量，进一步证明GDC是调控光呼吸代谢速率的一个限速酶[67, 116]。相较于野生型，GDC-H与GDC-L过表达拟南芥植株的光呼吸速率上升10%~25%，净光合速率上升15%~25%，生物量增加达33%~47%[116-117]。在大田种植条件下，GDC-H过表达烟草的光合速率显著上升，生物量增加40%~47%[118]。也有研究报道，在拟南芥中过表达PGLP1可提高光呼吸代谢通量，过表达植株的叶片直径、地上部鲜重和干重分别增加11%、5%~9%和6%[2]。这些研究结果目前还未在主要粮食作物中进行验证，不过已有结果表明，过表达特定光呼吸基因可以反馈调节光合作用，这为通过光呼吸改造提升植物光合效率提供了新的思路。
3.3 在C3植物中创建光呼吸代谢支路光呼吸代谢在线粒体中释放的CO2不能及时有效地被重新固定。因此，构建光呼吸支路的主要目标是在线粒体甘氨酸脱羧反应之前，分流光呼吸中间代谢物至其他可减少碳素损耗的代谢途径，从而提高植物的净光合效率[119]。近十多年来，在叶绿体中将乙醇酸作为起始代谢物质，引入多个酶促反应将光呼吸碳回补至光合碳循环的光呼吸支路设计策略，被证实可有效提升C3植物羧化效率与生物量(表 2)。
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表 2 近年来主要光呼吸支路基因元件与增产效果 |
2007年，Kebeish等[120]首次将大肠杆菌甘油酸代谢途径引入拟南芥构建了GGT光呼吸支路，该支路把大肠杆菌来源的乙醇酸脱氢酶(GDH)、乙醛酸聚醛酶(GCL)和羟基丙二酸半醛还原酶(TSR)导入拟南芥叶绿体，分流光呼吸乙醇酸生成甘油酸并同时释放CO2。此途径在叶绿体中形成的甘油酸可直接回补至光合碳循环，而释放的CO2则能提高叶绿体中Rubisco周围的CO2浓度。从能量的角度分析，GGT途径比植物本身光呼吸途径更节省能量[120, 126]。与野生型相比，GGT拟南芥植株的CO2补偿点降低，净光合速率和生物量显著提高。该支路后续还被导入马铃薯、亚麻荠和黄瓜等作物，也显著提高了相关作物的光合效率与生物量[127-129]，这条支路的高光效表型性状与系统模型的计算分析结果一致[130]。另有一个出乎意料的结果是，仅将大肠杆菌GDH单独导入到拟南芥和马铃薯叶绿体中，转基因植物光合效率和生物量(或产量)也显著提高[120, 128]，这表明叶绿体中可能存在其他的乙醛酸代谢产生CO2的途径[131]，但有待进一步的实验验证。
Maier等[121]将拟南芥GLO、南瓜苹果酸合酶(MS)和大肠杆菌CAT导入拟南芥叶绿体(GMC支路)。该支路首先利用外源导入的上述代谢酶催化光呼吸乙醇酸生成苹果酸，生成的苹果酸再通过内源的苹果酸酶和丙酮酸脱氢酶转化成CO2，进而形成CO2浓缩机制提高Rubisco羧化效率。能量计算分析显示，GMC途径可能比植物内源光呼吸途径更加耗能，但却表现出了更高的净光合速率与生物量[121, 126]。
South等[122]在烟草中再次验证了上述起始于乙醇酸分解代谢的光呼吸支路，该研究在烟草叶绿体中构建了三条支路：支路1是重复GGT途径，即在叶绿体中导入大肠杆菌GDH、GCL和TSR；支路2是重复GMC途径，即在叶绿体中导入拟南芥GLO、大肠杆菌CAT和南瓜MS；支路3是在叶绿体中导入莱茵衣藻GDH和南瓜MS，同时利用RNAi下调乙醇酸转运蛋白PLGG1的表达，以抑制乙醇酸转运出叶绿体，提升上述光呼吸支路分流效果。温室种植条件下支路1和支路3转基因烟草植株的光合速率与生物量均显著上升，田间试验发现支路3可使烟草的生物量增加25%，而且下调PLGG1后可增产40%[122]。该研究首次在大田种植条件下系统验证了光呼吸支路对C3植物光合作用与生物量的促进作用，揭示了光呼吸支路改造在农业生产方面的应用潜力。
本课题组在水稻中创建了两条新的光呼吸支路：(1)在水稻叶绿体中导入水稻自身的三个酶，即水稻GLO、草酸氧化酶(OXO)和CAT，分流乙醇酸直接在叶绿体中分解释放出CO2 (GOC支路)；(2)在水稻叶绿体中导入水稻GLO、大肠杆菌CAT、GCL和TSR，使光呼吸产生的部分乙醇酸直接在叶绿体内转化为甘油酸同时释放CO2 (GCGT支路)。与野生型相比，GOC和GCGT植株的净光合速率分别提高15%~22%和6%~16%，生物量提高14%~35%和16%~28%，春季大田产量提高7%~27%和13%~27%；但两条支路均出现了结实率下降的问题，尤其是秋季大田种植的下降幅度更大，导致其籽粒产量不升反降[123-124]。通过对其结实率下降机制的研究发现，高光效水稻中淀粉等光合产物在茎和茎鞘中大量积累，导致光合产物转运不畅从而影响了“源-库-流”的协调性，最终导致花粉育性下降、结实率降低(未发表数据)。此外，该途径还有可能在特定环境下影响植株的H2O2代谢[84-85]。总之，GOC与GCGT支路是首次在主要粮食作物中适配成功且在大田种植条件下能显著提升C3作物光合效率与产量的人工支路。
上述光呼吸支路通过分流乙醇酸代谢，使原本在线粒体释放的CO2部分或全部释放到叶绿体，以此形成CO2浓缩机制以提高Rubisco羧化效率。但这些支路仍涉及叶绿体中的CO2释放和碳损失，不尽完美。β-羟基天冬氨酸循环(BHAC)是近年来发现的一种微生物乙醇酸同化途径，该代谢途径可将乙醇酸氧化为乙醛酸，再经过酶促反应将其转化为草酰乙酸(C4光合途径的代谢物)，全过程不存在碳氮损失[132]，理论上BHAC途径比之前报道的光呼吸支路具备更高的固碳效率。2021年，Roell等[125]成功将BHAC途径导入到拟南芥过氧化物酶体。表型观测发现，在大气CO2条件下BHAC拟南芥的生长受到抑制，但在高CO2条件下可正常生长。代谢物分析表明，BHAC拟南芥可显著积累草酰乙酸，并且草酰乙酸可被高效转化为天冬氨酸等。此外，BHAC拟南芥中3-磷酸甘油酸水平降低，说明其本底光呼吸途径被抑制，回流至光合碳循环的光呼吸碳素减少，而新生成的草酰乙酸无法在C3植物中有效回补至光合碳循环。因此，BHAC途径降低了正常CO2条件下的光合同化效率，影响植物生长。该研究成功将BHAC途径引入C3植物，并通过把光呼吸代谢物转为C4光合途径代谢物草酰乙酸，成功将光呼吸和C4代谢相耦合，为将来在C3植物中构建依赖于光呼吸的碳富集新机制提供了思路。
近年来，计算工具被广泛用于新代谢途径的系统设计，Trudeau等[133]基于计算设计与定向进化策略，人工合成了一种羟乙酰CoA合成酶(GCS，可将乙醇酸转化为羟乙酰CoA)，并利用GCS与自然界现有的酶设计了一条分流光呼吸乙醇酸生成RuBP的途径，该合成途径不释放CO2，而合成的RuBP可用作Rubisco催化反应底物；模型计算分析显示，这条合成的光呼吸支路可增强碳的固定。该团队[134]后续又开发了一种新的羟乙酰CoA羧化酶(GCC)，与Rubisco等天然CO2固定酶相比，GCC催化效率更高。利用GCS与GCC组成羧化模块，可将乙醇酸转化为甘油酸回补进入光合碳循环。根据化学计量，若将GCS-GCC模块与自然光呼吸等过程相连接，预计可使植物的固碳效率提高75%~150%。上述代谢模块目前还未在C3植物中转化，但提供了通过人工设计新的代谢酶与代谢途径来提升植物光合效率的新思路。
4 展望植物光呼吸已经历25亿~32亿年的演化历程，有人认为历经漫长演化选择的光呼吸代谢应已趋于完美，人为改造优化光呼吸的可行性存疑。然而，从演化的角度看，光呼吸的出现是植物适应不断变化的环境的必然结果，生物演化往往只为存活与繁衍而牺牲其生产力和效率，因此，现行的光呼吸途径对高光效未必是最优的方案。近年来对C3植物光呼吸代谢的改造取得了重要进展，多个改造支路显著提高了植物正常生长条件下的光合效率和生物量。但光呼吸影响植物整体代谢，是所有光养生物不可或缺的代谢途径。因此，光呼吸改造应遵循适时适量分流代谢的原则，重构的光呼吸支路应尽量避免对植株基础代谢造成负面影响，这也是未来改造光呼吸创制高光效作物值得关切之处。
光呼吸与体内多个基础代谢相互关联，解析其调控机制应该是未来一个重要的研究方向。所有光呼吸酶都是潜在的多种翻译后修饰靶标，包括蛋白质磷酸化和氧化还原修饰。然而，这些修饰还需要进一步的验证，尤其是体内的验证，以了解它们的生理功能及其与环境变化之间的关联。这些翻译后修饰可能成为未来调节光呼吸的靶标，为提高植物环境适应性和创制高光效作物奠定基础。
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