摘 要：
1 国内外研究现状和发展趋势
1.1 总体概况 与2000多年悠久的养鱼历史相比，我国较大规模开展鱼类遗传育种研究的历史仅有20多年。研究历史虽短，起步虽然远远落后于发达国家，但传统产业与现代生命科学的结合，特别是20世纪80年代以后与细胞工程和基因工程等高新生物技术的结合，使这一研究领域很快出现生机。短短20多年来，我国不但在育种技术方面取得了重大进步，建立了杂交、细胞核移植、细胞融合、染色体组倍性操作、雌核发育、雄核发育、基因转移等育种技术，并逐渐形成了多种技术综合配套的技术路线，不断向社会推出了许多具有重要经济价值的养殖新对象[1]。
随着人和其他主要动植物基因组的破译，模式动物和经济动物基因组计划方兴未艾，越来越多的鱼类被提上议程，如河鲀、斑马鱼、青鳉鱼、剑尾鱼、沟鲶、罗非鱼和大西洋鲑等。河鲀的基因组测序计划主要由新加坡、英国、法国和美国科学家进行，由于其基因组较小，测序工作已基本完成；斑马鱼主要有欧美实验室参与，其全基因组测序已基本完成；青鳉则是以日本为主，以德法为辅，其全基因组测序可望在1~2年内完成；大西洋鲑是挪威和加拿大的合作项目，尚处于启动阶段；沟鲶则限于美国。在虹鳟中已分离了许多微卫星标记，已建立了两个详细的遗传图谱，大规模EST测序正在开始。基因组测序及其序列分析就像编篡一部巨大的百科全书，可为研究养殖鱼类的生长、发育、繁殖、遗传变异、疾病、与环境的相互作用(包括抗逆能力)及其遗传改良提供重要的参考，甚至指导信息[2]。譬如，Power等[3]认为比较基因组学为研究鱼类的比较内分泌学提供了有效的工具。
1.2 关于生殖调控机制研究 鱼类的生殖是一个复杂的过程，涉及到许多相关事件，如原始生殖细胞的形成与迁移、生殖细胞的增殖与凋亡、配子的形成、受精过程中精子的激活、精卵的识别、多精入卵的阻滞、卵子的皮层反应、精核的解凝以及原核的形成等。在已知的非哺乳动物中，原始生殖细胞(PGC)的发生由卵细胞质内的生殖质所决定。现今有关精卵识别与早期精卵结合机制的研究仍然主要集中在哺乳动物的小鼠和两栖类的爪蟾[4]，对鱼类的研究刚刚起步，有关鱼类精卵表面受体的性质和理化机制的了解较少。在受精过程中，多种蛋白激酶的级联活化以及对卵母细胞内蛋白分子的磷酸化修饰，精密调节着卵子成熟和受精。如酪氨酸蛋白家族(TPKs)的某些成员在受精前处于没有活性的状态，受精时发生自磷酸化，从而具有蛋白激酶活性。TPK介导的信号转导在海胆、爪蟾等动物的受精过程中起到调节钙离子活动，并可能参与受精后阻碍多精入卵。目前，已经在斑马鱼等鱼类的卵母细胞中鉴定和分离出酪氨酸蛋白激酶家族的部分成员，如Fyn，但是关于这些蛋白激酶在鱼类受精中的具体功能还未见报道[5]。
任何胚胎发育事件，包括细胞的扩增、分化、程序性死亡和形态发生等都依赖于特定基因在正确时间和空间被激活表达。基因正常表达受到抑制或者在不适当的时间或部位表达都会导致细胞增殖和发育受阻，甚至导致灾难性后果。胚胎发育背后的分子机制是基因选择性表达，这种差异表达受到精确调控[6]。现在一般认为，在水产养殖上，鱼类早期的发育阶段是苗种培育的关键，许多名贵鱼类的苗种生产难题长期不能很好解决，其中就与早期发育的生理生化调控机制不明有关。
对两性生物而言，性别决定与分化是个体正常发育、生存不可缺少的一环，也是种族繁衍得以延续的物质基础。性别分化是一个复杂的有关分化的多基因调控事件，是对两套可轮换的遗传程序之一的精确决定和执行[7]。动物的性别决定是生物学中一个重要的研究领域，其分子机制在果蝇、线虫和哺乳动物中研究得较为详细[8]。在人和小鼠中通过突变分析，已发现了一些调控早期性腺发育的基因和性腺分化的基因[9]，但这些已鉴定的基因仍不足以解释所有的性反转和生殖力障碍病症。因此，依然有许多非常重要的与性别调控相关的基因尚未被发现。目前鱼类因其特殊的进化地位和多样性已成为研究性别分化和决定的一类极具吸引力的动物资源，它不仅在脊椎动物的系统演化中承先启后，把握着揭开包括人类在内的所有脊椎动物进化奥秘的关键，而且囊括了从雌雄同体到雌雄异体、从环境控制到遗传调控等各种性别表现形式，为研究性别决定基因的结构、表达以及评价这些基因在性别级联调控通路中的功能和在进化中的保守性提供了各种可能[10]。在青鳉的Y染色体性别决定区域已鉴定出一个DMY基因，各种证据表明，它极有可能是青鳉在功能上对应于哺乳动物SRY基因，启动雄性发育过程[11]。
1.3 关于生长控制机理及与生殖关系研究 在鱼类养殖生产中，选择比较理想的养殖品种通常考虑的标准是：生长快速且体形较大，生殖力较强；肉质好、抗病能力强等等。生长和生殖是密切联系的，从经济观点看，增加生长的优势而影响生殖的优势，或者相反都是不可取的。一个养殖品种只有同时能发挥生长和生殖的优势，才是真正的优良品种。因此，对鱼类生长和生殖之间的相互关系以及对它们的神经内分泌调控机理的深入研究和了解不仅具有重要的理论意义，而且必将对提高鱼类养殖产量起重大作用[12]。
目前对鱼类的生长和生殖活动的生理学研究虽较普遍，但对与生长、生殖相关基因的鉴定及其分子基础的研究远远落后于陆生家养动物，国际上也是近几年才刚刚起步。鱼类与其他脊椎动物相似，下丘脑—垂体—靶器官是调节生长和生殖活动的重要内分泌系统。研究已知一些神经内分泌因子，如促性腺激素释放激素、促性腺激素、生长激素、催乳激素、类胰岛素样生长因子、性激素等是其中最重要的功能因子，但依然存在着许多潜在的调控因子尚未被发现[13]。鱼类的生殖调控研究在我国具有较好的工作基础，林浩然等系统深入地研究了鱼类生殖和生长的神经内分泌调控，阐明鱼类脑垂体促性腺激素的合成与释放受到下丘脑神经内分泌双重调节的作用机理，并根据这一创新理论研制成功新型高活性鱼类催产剂，适用于各种淡水养殖鱼类人工繁殖，在国内和国外推广应用，获得显著应用成效，对我国鱼类养殖产量近年来大幅度增长起了重大作用，被誉为鱼类人工催产的第三个里程碑，国际上定名为揕inpe Method?林彼方法)，已为各国学者公认和引用。
个体大小调控是影响动物生长和发育的关键过程之一。许多实验证明，基因的组成对器官乃至个体大小的调控起着决定性的作用[14]。虽然不同物种和种群的个体大小差异很大，但在同一种群内部，个体和器官的大小却是大体相当的。从个体较小的一种蝾螈获得的肢体和眼睛移植到个体较大的另一种蝾螈，移植物并不因受体较大而长得比原来更大。如果把果蝇未成熟的器官芽移植到成虫体内，它们只会继续成长到正常大小，而不会持续长大。虽然一直公认特定基因对动物的个体大小调控发挥了关键作用，但哪些基因通过什么途径如何起作用，一直以来是个谜。从理论上讲，器官或个体含有的细胞数量和单个细胞的大小都会影响其个体大小。与细胞大小相比，细胞数量对器官和个体大小的决定可能更加重要。体重70公斤的人体内存在约1013个细胞，而重约25克的小鼠体内仅存在3?09个细胞，可见人和小鼠个体大小的差异主要由细胞数量的差异造成的。Xu等[15]通过嵌合体筛选在果蝇中发现了lats基因。该基因突变可造成幼虫个体或器官与野生型相比增大10倍以上，这表明lats参与调控个体和器官的大小。lats的功能从果蝇到人是保守的，因为人lats同源基因可以用于拯救果蝇lats基因突变造成的表型。深入研究表明，lats通过抑制cdc2活性参与调节细胞周期，同时可以通过促进BAX活性参与调控细胞凋亡[16]。对lats的深入研究将有助于了解细胞数量在器官和个体大小调控中的作用。由于大部分鱼类存在终身生长的现象，而人们对于个体大小调控的认识亦刚刚开始。因此，在鱼类中是否存在个体大小调控的机制尤其值得探讨。
1.4 关于免疫和抗病机理研究 多年研究表明，鱼类同样具有两大免疫系统：不完善的特异性免疫系统和较完善的非特异性免疫系统。从20世纪的90年代开始，国际上一些发达国家纷纷起步开展水产养殖鱼类疾病相关基因的研究，并在特异性免疫因子，如免疫球蛋白基因，以及非特异性免疫基因，如趋化因子、细胞因子、补体、自然抗体、抗微生物多肽等鉴定和克隆方面取得进展[17]。近年来，鱼类非特异性免疫系统的分子研究又有重大突破，如已经成功鉴定包括鱼类干扰素基因在内的和在抵抗病毒入侵发挥重要作用的一些干扰素系统相关基因[18~19] ；成功克隆在抵抗多种病原菌感染中发挥重要作用的免疫因子，如抗菌肽、天然抗性相关巨噬蛋白等，并进行了初步研究。此外，研究表明，鱼类的主要组织相容性复合物(MHC)也具有多态性，而且MHC基因位点的差异也与鱼体的抗病毒和细菌感染能力密切相关[20]。
国内鱼类抗病领域的研究起步虽晚，但近两年来也取得了重大进展。在鱼类抗病毒免疫的研究中，中科院水生所通过鱼类干扰素的诱导和鉴定、文库构建，进一步探索建立了研究鱼类抗病毒相关基因和免疫相关基因的细胞模型系统和方法，并从该细胞系统中成功鉴定了近50个与细胞抗病毒感染相关的基因[18]，包括特异性识别病毒感染的鱼类细胞非特异性免疫受体TLR3、干扰素基因、干扰素系统信号传导基因STAT1、JAK1，干扰素激活的抗病毒基因Mx、PKR、Viperin、IFI56、IFI58、ISG15等等，从分子水平证实鱼类也利用与哺乳类相似的干扰素系统和抗病毒蛋白来抑制病毒的复制、维持细胞的正常生理功能[21~23]。在抗细菌病的研究中，筛选到包括抗菌肽基因、MHC IIa和b基因及天然抗性相关蛋白基因在内的10多种鱼类抗病和免疫相关功能基因并进行了初步研究[24]。
1.5 关于抗逆机理研究 温度与鱼类的生理、发育和繁殖密切相关。抵抗低温能使许多经济鱼类的育种成本降低，养殖面积扩大。过去几十年来，人们从许多侧面，如酶的低温适应和生物抗冻剂等多方面对鱼类的抗低温机制进行了研究。然而，耐寒是多基因性状，涉及的机制相当复杂；而阐明细胞中低温反应的信号传递过程是全面了解耐寒机理的关键。近几年来，该信号传递过程中的一些重要分子已被陆续发现。 McKemy 等[25]和Peier等[26]分别在小鼠和大鼠的神经元上发现TRP 类Ca2＋离子通道是动物神经细胞感受低温的受体分子。在低温诱导的基因转录水平的调控上，已发现低温可导致动物脂肪组织中线粒体数量增加、呼吸加快、产热提高[25]。终年生活在极端环境下的耐寒鱼类，在几千万年的进化历程中使它的细胞产生了许多低温适应机制。如它们的基因组中存在成员复杂的抗冻糖蛋白基因家族，编码抗冻蛋白以抑制冰晶在体内的生长[27] ；它们的循环和呼吸系统、脂肪代谢系统和细胞骨架的分子结构都与生活在温带的鱼类有很大差异。近年来鱼类耐寒机制方面的研究已开始用DNA分子标记探索耐寒性状与分子标记的连锁关系，美国农业部基因组计划中也有从基因组水平定位罗非鱼与耐寒相关的QTL，但研究进展还没有报道。
在保护水生态环境的大前提下，集约化养殖已成为水产业发展的根本出路。阐明鱼类细胞耐受低氧的分子机制，将为培育出适于集约化养殖的耐低氧的优质品种奠定基础。在哺乳动物和人体细胞内存在着一类介导低氧适应性反映的转录因子，能激活许多低氧反应性基因的表达，是在低氧条件下维持氧稳态的关键性物质，称低氧诱导因子。自1992年发现低氧诱导因子- 1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)以来，1997年和1998年又相继发现了HIF-2和HIF-3a[28]。研究表明，缺氧均可诱导HIFs转录、翻译及活性，其在体内介导生理或病理作用均依赖于通过与目的基因的缺氧应答元件结合而调节目的基因的表达来实现。到现在为止，已发现20多种目的基因, 且越来越多的直接或间接目的基因仍在不断的发现之中。在铁代谢中的目的基因有转铁蛋白受体、血浆铜蓝蛋白等；在血管生成中VEGF是最主要的HIF-1目的基因；在糖代谢中许多与葡萄糖摄取及糖酵解的基因均为HIF-1目的基因[29]。Marx[29]认为与哺乳动物中HIFs的广泛和深入研究相反，鱼类中的HIFs的研究则刚刚起步。近年来研究人员开始从虹鳟等鱼中克隆鱼类HIF-1，并初步研究它们在不同氧气压力下的表达情况[30]。
1.6 关于分子标记及其辅助育种研究 由于适应不同的环境以及长期进化和遗传变异的积累，许多鱼类具有丰富的品系(亚种)或地理种群，它们一般有独特的生物学特点和不同程度的遗传异质性，某些性状(表型)可能具有经济或遗传育种研究价值。利用不同的育种和生物技术手段，将不同的品系或品种的优良性状进行转移、整合或固定，是培育良种的有效途径，其中家系选育是遗传育种中经典和有效的方法。国内外利用家系选育方法获得了许多优良的养殖品系，例如对虹鳟长达几十年的连续选育，其产量提高了几十倍，从而使得虹鳟成为几个发达国家的水产养殖支柱品种。但是, 传统选育方法存在最大的问题是周期长，对低遗传力的性状选育效率低下。近10年来, 国际上鱼类遗传育种的研究趋势是将选择育种与现代育种生物技术特别是分子遗传标记技术结合，形成分子标记辅助育种技术，提高了育种成效。
鱼类分子标记辅助育种，特别是经济性状的QTL定位研究[31]，在国际上还处于起步阶段，其理论框架和实际应用还远未成熟。尽管如此，日本等国家的学者对某些经济性状控制位点进行的QTL定位，以及对虹鳟抗IPN(传染性胰脏坏死)和抗IHN(传染性造血器官坏死)病毒病标记以及牙鲆出血性淋巴囊肿(lymphocystis)抗病性标记的初步应用试验证明，标记辅助选择的效果良好，是一个切实有效的育种新途径[32]。与性别染色体或性别决定基因相关联的分子遗传标记也在一些鱼类种类中被发现，并且已经在少数种类中被用来进行表型性别的遗传鉴定[33]。
1.7 关于基因操作技术研究 基因转移作为研究基因功能和改造生物遗传结构的一种常用手段，在技术上已经相当成熟。把外源DNA注射到受精卵细胞中是最常用的方法。但是，目前常用的转基因技术所产生的动物都存在一个明显的问题，即外源基因在动物体内的表达常常不正常。这种状况，既影响了通过转基因鉴定基因功能的效果，也阻碍了用转基因技术进行物种改造的应用前景。外源基因在受体动物中的表达受基因两端调控序列的控制，还与基因构件在基因组中的插入位置有关。阐明基因的调控序列是一个艰巨的任务，动物基因的编码区以及调控序列的平均长度往往超出传统质粒的DNA克隆能力，从而使基因时空表达及调控规律的发现比较困难。BAC克隆技术的出现，大大提高了DNA片段的克隆能力。BAC一般可带动200kb左右DNA片段正常复制。BAC基因组文库克隆的平均长度大约在150kb上下，大多情况下包含基因正确表达所需的所有调控元件，并可以得到重复性很好的转基因效果。利用BAC克隆以及国际基因组计划所产出的组织特异性EST的表达信息，Gong 等[34]挑选了300多个在小鼠中枢神经系统中表达的基因，以EGFP作为标记分子代替这些BAC克隆中的一小段蛋白编码区，把这些BAC－EGFP构件转入小鼠受精卵，形成转基因小鼠。根据转基因小鼠中枢神经系统细胞的荧光分布，展现了这些基因在神经系统中的表达图谱；中枢神经系统中的各类细胞也可根据这些基因的不同表达状况而很容易区分，通过数据和图像的整合，使细胞间的相互关系，如突触连接的形式等精致结构一览无余；通过对这些转基因小鼠发育过程的跟踪，还阐明了中枢神经系统发育过程中细胞的迁移，以及所涉及基因的功能[35]。这种高通量的转基因研究，可以从整体水平阐明基因的时空表达规律和调控网络，是系统生物学的重要研究方法。在哺乳动物中可通过细胞水平的体外基因操作而获得目的基因定点整合的转基因家畜，由此呈现出该技术应用于经济动物定向品种改良的诱人前景[35]。然而，此类研究在鱼类中仍然相对滞后，其主要障碍之一是在大多的鱼类中尚未最终建立便于基因操作、能够稳定培养的干细胞系。因此，在鱼类中，亟待建立和完善胚胎干细胞和生殖干细胞系，通过体外基因操作和筛选，利用嵌合体或细胞核移植技术进行个体重建，以及进行BAC转基因研究。在此技术基础上，可以快速获得大量具有目的性状的转基因鱼，这是一项极具前途的研究，并已取得了重要进展[36]，将在理论和实践上具有双重的重要意义：一方面将为鱼类功能基因组研究提供扎实可靠的技术平台；另一方面将极大地推动鱼类品种改良的研究进程。
RNA干扰(RNA interfering)技术所介导的基因knockdown已成为基因功能研究的重要手段，而小分子干扰性RNA(short interfering RNA, siRNA)的发现，更极大地丰富和拓展了该技术的应用领域。2002年，Science杂志将有关siRNA的作用与应用研究评为“年度十大进展”之首。相关研究亦在2001及2003年Science杂志所评选的“年度十大进展”中位列前茅。然而，在鱼类系统尚未建立日常实验室可操作的、简洁高效的siRNA技术平台[37]。目前，以siRNA技术进行病毒性疾病的防治已成为其应用领域一个新的增长点。草鱼是我国重要的经济鱼类之一。然而，病毒性疾病——特别是草鱼出血病在过去几十年均对水产业造成严重危害，人们对于其防治尚无十分有效的手段。最近，草鱼出血病病毒的全基因组研究已取得重要突破[38~39]。结合已测定的草鱼出血病病毒全基因组序列，以草鱼出血病的防治为模型，开展抗病转草鱼出血病病毒siRNA基因鱼的研究，将有助于揭示siRNA在鱼类中的分子作用机理，进而开辟其应用于鱼类品种改良研究的新领域。
2 面临的主要问题
近年来，由于生命科学和生物技术的进步和发展，人类不但已从功能基因的克隆、鉴定和分析中获得了大量鉴别重要动植物品种资源的知识，而且还从基因工程和细胞工程等生物技术的创新和应用中培育出了推动农业进步的新型品种。然而随着水产养殖业的快速发展，品种和病害问题成为制约我国水产养殖业进一步健康可持续发展的瓶颈因子。我国主要水产养殖品种缺少优良品种，原因之一是长期以来鱼类遗传育种的基础投入太少，特别是对淡水养殖业投入太少，基础资料积累不足，新技术发展和应用缓慢。水产养殖业在国外也是一个快速发展的新行业，但由于过去发达国家的水产养殖产量都不是很高，科研投入相对较低，与农业相比较，基础研究，如各种主要养殖鱼类的遗传基础、病害发生、生长、成熟、性别控制等重要生理过程的研究都很不深入。但近年来由于认识到水产养殖的重要性，已在遗传基础研究方面加大了投入。美国在1997年10月启动了水产养殖动物的基因组计划，列入了5种主要水产养殖动物。发达国家的一些大公司也开展了这方面的研究，如挪威的Bio Soft公司就开展了罗非鱼遗传连锁图谱的研制工作。最近，美国和加拿大学者正在着手开展虹鳟鱼的基因组计划研究[40] ；2003年又启动了罗非鱼的全基因组测序和功能基因组计划；挪威2002年开展了大西洋鲑全基因组测序和功能基因组研究。可以预见，发达国家水产养殖动物的基因组资源将会以更快的速度增加。近年来，一些新兴、高效的功能基因组研究手段在哺乳类模式动物中发展起来，并已开始应用于经济哺乳类的快速、定向育种研究；然而相关研究在鱼类中仍处于起步阶段。过去，我国学者曾在鱼类基因转移方面做出世界首创的成绩[41] ；今天，我们若能把握住此研究领域的契机，便有可能在鱼类定向、快速育种的国际舞台占据关键角色。因此，我国利用国家行为，加强这一过去在我国曾有瞩目成就，现仍有竞争优势领域的基础研究，是水产养殖业健康持续发展的关键。
概括来说，鱼类品种改良的遗传和发育基础研究的科学问题有两个，且这两个科学问题紧密相关，一个是鱼类品种改良的理论基础；另一个是鱼类品种改良的技术创新。
第一个科学问题的内涵主要有: 如何培育生长速度快、繁育能力强的优良品种？重点是要了解鱼类生殖和生长之间的密切联系和相互作用机制; 如何提高鱼苗的存活率？关键是阐明人工育苗的理论基础——生殖调控和胚胎发育的分子机制；怎样才能获得饲料利用率高的新品种？其途径之一可通过了解鱼类不同生长阶段相关基因的表达差异及其调节机制来解决；如何快速有效地培育全雌性或全雄性的优质商品鱼？关键是要阐明鱼类性别分化的调控机制并由此发展相应的性别控制育种技术；怎样才能有效地培育抗病的鱼类新品种？其根本在于掌握鱼类机体自身的免疫抗病机理，鉴定出重要的可抵御病毒和病菌等病原侵袭的抗病基因，培育出天然抗病力提高的新品种，这样才会减少病害的发生，避免滥用抗生素类药物带来的水环境污染和水生态系统破坏的恶果；不同鱼类或同一种鱼的不同地理种群存在抗逆性差异，鉴定造成这些差异的基因，了解它们耐受逆境的分子机制是培育抗逆鱼类新品种的基础。
第二个科学问题的内涵主要有: 控制鱼类生殖、生长、抗病和抗逆等主要经济性状的功能基因是进行鱼类品种改良和分子育种的基础；与重要经济性状相联系的分子标记是进行分子标记辅助育种、提高选育效率的工具；快速、定向的基因操作技术是鱼类品种改良的技术保障。综合利用这些功能基因和分子标记，建立高效可行的鱼类分子育种研究平台，是进行鱼类品种改良的技术源泉。
3 研究思路和前景
鱼类品种改良的遗传与发育基础研究已受到发达国家的重视和关注，许多国家已投入重要的人力和物力加强研究。作为水产养殖大国的中国，更应在过去工作的基础上加强研究，抓住机遇，由此推动我国水产养殖的可持续健康发展。
研究思路应针对入世后我国农业发展与贸易对优质水产品的迫切需求和鱼类品种改良基础研究相对落后的严峻形势，通过鱼类生殖的调控机制研究、生长调控的分子机理研究、抗病的分子机理及其功能基因研究和抗逆基因的克隆鉴定及其抗逆机理研究，微卫星等遗传标记的筛选和分子标记辅助育种的应用基础研究，品种快速、定向改良的基因操作技术基础研究，在理论上揭示鱼类生殖、生长、抗病和抗逆等主要经济性状和重要生命现象的分子机理，奠定鱼类品种改良的理论基础；在技术方法上，建立开展鱼类功能基因研究的技术平台，取得一批重要的功能基因资源，发展进行鱼类品种改良的快速、定向基因操作技术，开拓鱼类品种改良的技术途径。
通过这些研究，揭示鱼类生殖、生长、抗病和抗逆主要经济性状和重要生命现象的分子机制，解决鱼类品种改良中的理论基础和技术创新等与渔业可持续发展紧密相关的两个关键科学问题，使我国在鱼类经济性状的遗传与发育生物学和功能基因研究中居国际前沿水平，为我国水产养殖业的可持续发展和渔业生物技术的创新做出贡献。
[参 考 文 献]
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