摘 要：
疾病和创伤引起的组织、器官的缺损或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是导致人类死亡的最主要原因。如何克服自体或异体组织、器官移植中存在的“以创伤修复创伤”、供体来源不足等缺陷，从根本上解决组织、器官缺损修复和功能重建等问题，已成为生命科学领域的国际性前沿课题。组织工程的提出、建立和发展，为解决这一问题提供了新的策略，它能以少量种子细胞经体外扩增后与生物材料结合，修复较大的组织或器官缺损，重建生理功能，为最终实现无损伤修复组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新途径。
在“973”项目“组织工程的基本科学问题”资助下，我们从5年前开展了组织工程的研究，经历了从无到有、从小到大的发展历程，在种子细胞、生物材料、组织构建等组织工程基本研究领域均取得了重要的研究成果，为我国组织工程研究的发展打下了基础。尤其是在组织构建和临床应用方面的优势，确立了我国在国际组织工程领域的领先地位。本文将围绕种子细胞、生物材料以及组织构建这三个组织工程研究的最基本要素，简单介绍该项目所取得的部分研究成果。
1 种子细胞
种子细胞是组织工程的首要因素，只有获得足够数量并保持特定生物学活性的种子细胞，才能保证组织构建的成功。
组织工程的最初设想是通过切取一小块正常同源组织，经体外培养扩增的方法得到大量的目的细胞，进一步与材料复合后构建出新的组织。研究发现成熟软骨细胞在体外培养条件下，很快老化而失去增殖能力[1]; 人表皮细胞随体外扩增，克隆形成能力逐渐降低[2~3]。这些研究提示终末分化细胞扩增能力有限，无法满足构建组织的需求，理想的种子细胞必须具备一定的体外增殖能力。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)是近年来研究最多的成体干细胞之一。BMSCs从骨髓中分离、培养后，可以通过添加生长因子等方法诱导向骨、软骨以及脂肪细胞分化[4~6]。进一步的研究发现，BMSCs在体外传代5代就能扩增100万到200万倍而仍然保持其多向分化潜能[7]，提示了应用BMSCs作为种子细胞构建骨、软骨以及脂肪组织的可行性。
BMSCs的体外成骨分化信号传导机制研究发现，MAPK和PI3K/AKT通路活化是BMSCs向成骨分化必需的信号传递途径，通过对这两条信号通路的调节，可以间接调节体外诱导成骨及体内骨组织构建的过程，为临床治疗性干预成骨的过程提供了信息。脂肪干细胞的分离、培养和鉴定，为组织工程构建提供了新的种子细胞来源。
同种异体细胞是种子细胞的另一重要来源。研究发现，人的原代软骨细胞表达MHC I类和II类抗原[8]; 淋巴细胞混合培养结果表明，人的软骨细胞具有免疫原性，提示同种异体组织工程化软骨植入体内可以诱发免疫排斥反应；而转染IL-10、 IDO或FasL基因的软骨细胞具有免疫负调作用，在混合淋巴细胞培养中抑制T细胞的活化[9]，这一研究为应用基因转染技术拓展同种异体细胞的应用提供了依据。
研究发现， BMSCs具有特殊的免疫调节功能。BMSCs免疫调节的主要机制是通过抑制树突状细胞发育和分泌IL-10、TGF-b等细胞因子，从而抑制异体T细胞的活化[10~11]。该研究为应用同种异体干细胞作为种子细胞进行组织构建及缺损修复提供了理论指导。体外培养的BMSCs与生物材料复合后，成功修复异体骨缺损，进一步证实了应用同种异体干细胞的可行性。
研究发育同源的细胞间相互转化的可能性，是寻找种子细胞来源的另一条途径。人皮肤真皮成纤维细胞与肌腱细胞的生物学性状研究中发现，两者在细胞形态、生长与基质合成等方面均非常接近。基因芯片检测结果发现这两种发育同源的细胞仅有3个基因表达的差异，为应用真皮成纤维细胞作为肌腱构建的种子细胞提供了理论指导[12~13]。
胚胎干(ES)细胞具有体外无限增殖和分化全能性，它在组织工程中的研究与应用将是组织工程未来的发展方向之一。应用诱导分化的小鼠ES细胞构建组织工程化血管以及诱导人ES细胞向表皮细胞分化的成功[14~16]，证实了ES细胞作为种子细胞的可行性。
2 生物材料
生物材料是组织工程研究的重要组成部分，也是影响组织构建最为关键的因素之一。组织工程生物材料必须具有可降解性、良好的生物相容性、低免疫原性以及一定的空间结构、孔隙率、降解速率等特性。生物材料的研究综合为以下几个方面。
2.1 新型材料的开发 新型生物材料，如可吸收性高分子材料——聚(乙交酯-丙交酯-己内酯)三元共聚物(PGLC)的研制开发，为组织工程材料的制备提供了新来源[17]。根据大部分动物细胞外都有一层糖-蛋白复合物的组成结构，研制了将葡聚糖引入聚乳酸的新型生物降解高分子材料——聚乳酸接枝葡聚糖共聚以及葡聚糖/聚乳酸共混体系，大幅度提高了支架的细胞亲和力[18]。开发了具有知识产权的新型生物降解性形状记忆高分子——PLA-PGC共聚物，可用于特殊形态组织的构建。研制了凝胶化时间可控、降解速率可控的新型可注射型水凝胶，并在此基础上共价引入了氨基酸以及RGD多肽，提高了细胞在凝胶中的粘附。进一步制备的相关微凝胶，具有“智能”响应性，可用于生长因子以及蛋白质药物的包裹和缓释。乙烯基、环氧基及异氰酸酯基等可降解生物交联剂与可生物降解粘合剂的合成，为制备一定空间结构的支架创造了条件[19~20]。
2.2 材料的表面修饰与改性 通过对材料表面的修饰与改性，可提高材料对细胞的亲和力与组织相容性。
通过物理截留或偶联方法，用ECM蛋白，如胶原或其部分变性衍生的明胶来修饰经控制水解活化的聚L-乳酸(PLLA)薄膜，制备了固定化胶原或明胶的仿生表面[21~22]。通过光接枝技术在生物惰性材料表面引入羧基、羟基、酰胺基等，既改善了材料的亲水性进而提高了材料的细胞相容性，又为后续细胞相容因子的引入打下了基础[23~24]。体外细胞培养证明，软骨、成纤维细胞和内皮细胞在上述杂化界面具有更高的粘附率、增殖率、细胞活性和分化能力。
利用无水氨等离子体处理聚内酯材料，成功地将氨基引入材料表面，再涂覆胶原时能增加胶原在表面的结合，改善了胶原在培养液中易流失的问题，使细胞黏附强度大大提高[25]。
天然细胞外基质组分(如透明质酸)或其结构类似物(如壳聚糖)，以及天然衍生聚合物水凝胶等常用于组织工程。生物材料表面的电荷密度及其分布会影响细胞行为，以带正电荷的壳聚糖与两性的明胶构筑的壳聚糖-明胶网络(CS-Gel)，能诱导小鼠成纤维细胞L929细胞进入正常细胞周期，促进细胞增殖，减少细胞的凋亡。用冷冻干燥法制备的壳聚糖-明胶复合物支架种植猪耳软骨细胞，经体外扩增后移植到猪的腹部皮下，16周后软骨形成，支架完全降解而无炎症反应，说明多孔壳聚糖-明胶复合物支架是组织工程化软骨的适用支架[26]。
透明质酸(HA)是哺乳动物组织和体液中最简单的糖胺聚糖，为了提高材料的仿生程度，将HA引入到壳聚糖-明胶(CS-Gel)复合物中，可缩短细胞在CS-Gel材料表面的适应期，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡[27,28]。同时HA的加入会抑制CS-Gel膜的降解。利用冷冻干燥法制备的CS-Gel-HA双层支架，适于人成纤维细胞及角质形成细胞的生长，适用于皮肤组织工程[29]。
2.3 支架构建的研究 不同组织具有不同的空间结构。因此，构建不同组织工程化的组织必须有相应结构的支架材料相匹配。
既能在体外进行细胞培养，又能通过注射进入体内，具有一定的强度、降解速度和孔结构可调的可注射型细胞支架——聚内酯生物降解性高分子微球的研制成功，有望成为多种组织工程有用的细胞支架。
聚乳酸-羟基磷灰石、PLGA-磷酸三钙、PLGA(70/30)/PLGA(50/50)等多种用不同材料制备，又兼具大小不同孔结构的复合结构细胞支架，能适应不同组织构建的需求。
利用环氧基生物可降解交联剂对天然材料，如透明质酸、海藻酸钠等进行交联，制备了一系列多孔膜、海绵等材料，生物相容性好、降解速率可调，增强了天然材料的力学强度，拓宽了其应用范围。尤其是透明质酸作为一种良好的角膜材料，透明度高，亲水性好，具有优异的拉伸强度。
一定空间结构与取相材料的制备成功，为一些特殊组织，如神经组织的构建提供了支架。
上述材料的研究与开发，为组织工程化组织的构建奠定了基础。随着组织工程的进一步发展，对生物材料提出了新的挑战，新型智能化材料的开发除了考虑生物安全性、相容性和免疫源性等因素以外，更期望植入体内的材料能诱发愈合反应，促进组织的再生与功能重建。
3 组织构建
组织工程化组织的构建是组织工程研究与应用的关键。 在组织构建过程中，除了上述提到的种子细胞和生物材料这两个关键因素以外，生物力学对组织工程化组织形成具有重要的影响。
实验结果显示，力学作用不但可以改变细胞的增殖、基质分泌等特性，而且可以调控干细胞的表型维持和分化。体外肌腱构建中发现，在牵张力作用下形成的肌腱，其生物力学强度明显优于无张力状态下形成的肌腱，其组织与胶原结构也更加成熟。体内肌腱构建也证实了力学作用的重要性。在组织工程化血管体外构建中发现，扩张性力学刺激使构建的血管富有弹性，形成更多的平滑肌和弹力纤维。在应用真皮成纤维细胞替代肌腱细胞构建组织工程化肌腱研究过程中发现，在力的作用下，原本表达I、III型胶原的成纤维细胞向以表达I型胶原为主的肌腱细胞表型转化。上述研究表明，生物力学不仅可以促进具有特殊力学性能组织工程化组织的形成，而且对不同类型细胞间的相互转化也起着一定的作用。
应用生物力学刺激原理，针对不同组织的构建需要，设计并制造了多种具有自主知识产权的细胞/组织动态培养系统与组织构建生物反应器，并成功应用于组织工程化组织的体外构建(详见代表性组织构建)。
组织工程研究的最终目标是应用构建的组织工程化组织进行缺损修复，达到形态、结构与功能上的重建。在充分动物实验的基础上，进一步通过组织工程的临床应用研究，证实了应用组织工程技术修复缺损的可行性，找到一条符合生物学思路的创伤修复治疗手段。代表性组织工程化组织包括软骨、骨、肌腱、角膜、皮肤、血管及气管等。
3.1 软骨组织工程 首先应用关节软骨细胞为种子细胞，与材料复合后修复兔骺板软骨损伤及猪关节软骨全层缺损，修复后的关节软骨在组织学、生物化学和生物力学等方面均与正常关节软骨非常接近，证明应用组织工程技术能够有效地修复关节软骨缺损，恢复功能[30~31]。
在建立了BMSCs分离、培养、扩增及诱导分化技术的基础上，以猪自体BMSCs为种子细胞，以PGA/PLA为支架材料，成功地修复了猪膝关节不同负重部位软骨与骨复合缺损。通过GFP基因转染标记技术证实了修复的组织主要由植入的BMSCs所形成。同时还发现植入的BMSCs在同一复合缺损的不同部位分别分化为软骨和成骨细胞，提示关节微环境对BMSCs向骨、软骨分化具有诱导作用[32]。
根据微环境对BMSCs诱导分化作用的提示，将猪的软骨细胞与BMSCs混合，再与Pluronic混合后注射到皮下，可以形成成熟的软骨组织[33]，进而以共培养为模式，将两种细胞混合接种在PGA/PLA支架上体外共培养，能形成良好的软骨组织，证实了软骨细胞能够提供软骨微环境，诱导BMSCs向软骨分化并形成软骨组织[34]。
应用经生长因子诱导的BMSCs与PGA/PLA支架复合，在体外构建组织工程化软骨的成功[35]，为摆脱软骨组织工程种子细胞不足的困境以及进一步的产业化发展奠定了理论与技术基础。
3.2 骨组织工程 通过对BMSCs体外生长特性及其向成骨细胞转化的系统研究，阐明了生长因子(BMP类、Vit D3等)的成骨诱导作用以及成骨分化过程中的信号传导与调控机制。在此基础上，将经诱导的BMSCs与骨组织工程材料复合，在动物自体皮下成功地完成了成骨实验，并应用GFP基因转染标记技术证实组织工程化骨由BMSCs分化所形成[36]。
应用自体BMSCs，根据不同缺损部位分别选择天然珊瑚、b-TCP及脱钙骨等不同支架材料，成功地修复了羊与狗的颅骨缺损[37]、狗的牙槽嵴骨缺损及下颌骨缺损[38]、羊的股骨缺损等多种骨缺损模型[39]，对修复结果进行了大体、X线、螺旋CT、组织学、生物力学等全面评价，证实了修复的有效性。
在大动物实验成功的基础上，进一步开展了组织工程骨的临床试用。修复了颅骨缺损、齿槽裂骨缺损、颅面部骨凹陷畸形、四肢骨缺损以及骨不连等各类骨缺损病例40余例[40~41]。通过数年的随访，系统地观察了组织工程骨在人体内的愈合、再生过程，并提供了相关组织学证据，客观地评价了其临床应用效果，为进一步开展骨组织工程的临床治疗积累了经验。
3.3 肌腱组织工程 将肌腱细胞与无纺PGA纤维复合，在自行设计的生物反应器内构建出成熟的肌腱组织[42]。在此基础上，应用自体肌腱细胞成功修复了鸡与猴的肌腱缺损[43]; 用转染BMP12基因的自体BMSCs成功地修复了兔与猴的肌腱缺损[44]; 应用自体滑膜细胞成功修复了鸡的腱鞘缺损；用自体皮肤成纤维细胞成功地修复了猪的肌腱缺损[45]。通过大体观察、组织学、生物力学等检测，证实了肌腱修复的有效性，为开展临床应用奠定了基础。
3.4 角膜组织工程 首先建立了角膜缘干细胞、角膜基质细胞体外分离、培养与扩增体系，系统研究了角膜缘干细胞、角膜基质细胞的体外扩增与功能老化规律。在此基础上，利用自体角膜缘干细胞和羊膜在体外构建了组织工程化角膜上皮，修复了灵长类动物猴的角膜上皮缺损。
诱导皮肤干细胞、胚胎干细胞向角膜上皮细胞分化的成功，为角膜上皮细胞来源提供了新的途径。应用诱导分化后的细胞构建的组织工程化角膜上皮，成功地实现了兔的眼表重建。术后角膜保持透明，证明体内角膜微环境可维持分化细胞的细胞表型[46~47]。
除了构建角膜上皮层以外，应用角膜基质细胞与可降解高分子材料(PGA)构建的组织工程化角膜基质层，成功地修复了兔的角膜基质缺损模型[48]。组织工程化角膜在动物实验中的成功，为临床解决移植角膜来源少的问题提供了可能。
3.5 皮肤组织工程 通过对细胞的体外扩增与功能老化规律的系统研究，阐明了金属离子、氨基酸、维生素、氧及抗氧化剂、生长因子与血清对角质细胞生长和分化的影响[49~53]。在此基础上，开发了新的细胞培养体系，显著提高了细胞扩增效果，延缓细胞老化，为大规模细胞扩增及未来的产业化奠定了技术基础[54]。
根据真皮层和表皮层构建过程的特点与要求，研制了一套小型生物反应器系统，为研究皮肤组织体外构建创造了条件[55]。在此基础上，应用组织工程技术修复猪的全层皮肤缺损，证实了组织工程皮肤用于缺损修复的可行性[56]。进一步应用脱细胞基质为支架构建的全层皮肤，修复了黑毛痣切除术后的皮肤缺损以及烧伤后的植皮等临床皮肤组织缺损病例[57~59]，展示了组织工程化皮肤的临床应用前景。
3.6 血管组织工程 骨髓内皮祖细胞向血管内皮细胞分化的研究以及骨髓基质干细胞向平滑肌细胞诱导分化的诱导，为血管构建初步找到了种子细胞的来源。应用小鼠胚胎干细胞分化来源的血管内皮细胞构建血管的成功[14]，为种子细胞来源找到了新的途径。
应用生物反应器体外构建了具有一定力学强度的组织工程血管平滑肌层，提示了力学在组织构建中的作用[60]。犬腹主动脉缺损修复试验的失败，进一步证实了组织构建过程中力学刺激的必要性。这些研究为组织工程化血管构建奠定了技术基础。
3.7 气管组织工程 首先应用软骨细胞为种子细胞、体外构建了组织工程化管状软骨组织，并证实能够在免疫功能缺陷的裸鼠体内存活。进一步应用BMSCs为种子细胞，在体外成功构建了组织工程化管状软骨，初步解决了气管软骨组织构建中的种子细胞问题。然而，应用单纯组织工程化管状软骨修复家兔气管缺损的失败，也提示了同时构建气管粘膜上皮的重要性，为进一步构建复合组织提供了指导。
通过“973”项目研究，我们不仅在组织工程基本研究领域均取得了上述重要的研究成果，特别在组织构建和临床应用方面的优势，使我国跻身于国际组织工程领域的前列，而且也建立了一支活跃的组织工程科研队伍。在来自军事医学科学院基础医学研究所、中科院化学研究所、中科院力学研究所、中科院生物医学工程研究所、四川大学、暨南大学、西北农业大学、浙江大学、天津大学、复旦大学、华东理工大学、第一军医大学、第二军医大学、第四军医大学、中山医科大学、上海第二医科大学等众多单位专家教授的共同努力下，顺利地完成了预期的研究目标。然而，在研究过程中我们也发现了众多科学现象，继续探求这些现象的科学本质，阐明组织工程化组织形成和转归过程中的影响因素与调控机制，将进一步推动组织工程研究的发展。
[参 考 文 献]
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